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六 检查化验（第2页）

2、PCR检测结果的确认

（1）使用原始标本重复PCR试验；

（2）在第二个实验室检测同一份标本。

3、实验室检测的几个问题

对PCR检测有如下要求：

①使用PCR方法进行SARS-CoV检测的实验室应该有PCR工作经验。应采用南控程序并确认一个合作试验室，以便于对阳笥结果进行交叉核对。

②对SARS-CoV特异性PCR试验阳性结果的确认应采用严格的标准，特别是在低流行区。

③SARS-CoV检测用试剂盒应具有国家有关机构颁发的许可证，应包括已公布的对照、PCR引物及工作流程，应使用权威机构提供的RNA样本作为阳性RNA对照。

④SARS-CoV试验的舔生取决于标本的收集和对患者检测的时间。采用ＰＣＲ方法会得到假阴性的结果，而多个标本和多部位取材可增加试验敏感性。

⑤严格执行实验室操作标准，避免阳性结果。

⑥在每次ＰＣＲ操作过程中，应包括合适的阴、阳性对照。在提取中应有一份阴性对照，在PCR运行中应有一份水对照，在核酸提取及PCR运行中应有一份阳性对照；患者标本检测必须要有阳性对照，以便测出PCR抑制物（即设抑制对照）。

⑦扩增第二组基因区或进一步增加试验的特异性。

⑧患者出现症状后5～7天内采集标本阳性率最高。

4、标本的采集、运送及保存

（1）漱口液

①采集：采集有助于提高病毒检出率。应在患者进食2小时后采集标本，期间尽量少喝水。取无菌生理盐水5ml盛装在15ml标准带盖密封一次性无菌塑料离心管内。选择发病早期（最好5天之内）的病例。采样时可让患者先咳嗽数声，然后用5ml无菌生理盐水漱口，漱口时让患者头部后仰，发出“噢声”，让采样液在咽部转动3-5秒，随后通过纸漏斗缓缓吐回离心管中。

②运送与保存：标本应置于冰块环境中（预先准备冰壶）在2小时内尽快送至实验室。标本至实验室后，应尽快进行处理及检测，如果在24小时内可安排检测，标本可置于4℃保存。如果未能安排检测，则放-20℃保存，需要长期保存应置于-70℃。

（2）粪便

①采集：使用清洁便盆盛装患者粪便，用灭菌竹签挑取含脓、血或黏液的粪便置于15ml标准带密封一次性无菌塑料离心管内。

②运送与保存：标本应置于冰块环境中（预先准备冰壶）在2小时内尽快送至实验室。标本至实验室后，应尽快进行处理及检测，如果在24小时内可安排检测，标本可置于4℃保存。如果未能安排检测，则放-20℃保存，需要长期保存应置于-70℃。

（四）T淋巴细胞亚群

1、外周血T淋巴细胞亚群检测诊断标准

大多数SARS患者外周血T淋巴细胞CD3＋、CD4＋、CD8＋亚群均减低，尤以CD4＋减低明显。

2、检测方法

应用流式细胞仪（Flow）对相应荧光抗体标记的样本进行检测，计算CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋细胞的百分比和绝对值。

3、结果解释

（1）百分比：SARS患者的CD3＋、CD4＋、CD8＋亚群的百分比可减低或正常。

（2）绝对值：SARS患者的CD3＋、CD4＋、CD8＋亚群明显减低，其中以CD4＋亚群减低尤为显著。

（3）CD4＋、CD8＋：正常或降低。

（4）个体差异：不同SARS患者之间存在着较大的个体差异，影响因素包括年龄、病情、病程、有无基础疾病、免疫功能状态等。

现已证实，T淋巴细胞介导的特异性细胞免疫功能低下是SARS患者的主要免疫病理改变之一，主要表现为T淋巴细胞及其亚群的明显受损，其中CD3＋、CD4＋、CD8＋尤为明显。另外，糖皮质激素的应用也会使T淋巴细胞亚群（主要为CD3＋、CD4＋、CD8＋）的动态检测，有助于SARS-CoV致病机制的研究和诊断，并且对于指导治疗（尤其是糖皮质激素应用的时机、剂量等）以及提示预后具有重要价值。但应用此标准诊断SARS时，应排除人类免疫缺陷病毒（HIV）和乙型肝炎病毒等感染、肿瘤、自身免疫性疾病、免疫缺陷病、血液系统疾病、肝肾疾病、糖尿病、器官移植等情况导致的CD3＋、CD4＋、CD8＋的变化。T淋巴细胞的受损与病情严重程度有明显相关性，即重型SARS患者较普通型明显，死亡病例T淋巴细胞的减低为可逆性改变，恢复期病例的T淋巴细胞及其亚群可逐渐接近或达到正常水平。